Kawano Y, Okamoto I, Murakami D, Itoh H, Yoshida M, Ueda S, Saya H
J Biol Chem 275: 29628-29635, 2000
CD44 is a cell surface adhesion molecule for several extracellular matrix components. We previously showed that CD44 expressed in cancer cells is proteolytically cleaved at the ectodomain through membrane-anchored metalloproteases and that CD44 cleavage plays a critical role in cancer cell migration. Therefore, cellular signals that promote the migration and metastatic activity of cancer cells may regulate the CD44 ectodomain cleavage. Here, we demonstrate that the expression of the dominant active mutant of Ha-Ras (Ha-Ras(Val-12)) induces redistribution of CD44 to the newly generated membrane ruffling area and CD44 ectodomain cleavage. The migration assay revealed that theCD44 cleavage contributes to the Ha-Ras(Val-12)-induced migration of NIH3T3 cells on hyaluronate substrate. Treatment with LY294002, an inhibitor for phosphoinositide 3-OH kinase (PI3K), significantly inhibits Ha-Ras(Val-12)-induced CD44 cleavage, whereas that with PD98059, an inhibitor for MEK, does not. The active mutant p110 subunit of PI3K has also been shown to enhance the CD44 cleavage, suggesting that PI3K mediates the Ras-induced CD44 cleavage. Moreover, the expression of dominant negative mutants of Cdc42 and Rac1 inhibits theHa-Ras(Val-12)-induced CD44 cleavage. These results suggest that Ras > PI3K > Cdc42/Rac1 pathway plays an important role in CD44 cleavage and may provide a novel molecular basis to explain how the activated Ras facilitates cancer cell migration. PMID: 10896935 [PubMed - indexed for MEDLINE]
CD44はヒアルロン酸を始めとする細胞外マトリックスに対する接着分子である。癌細胞ではCD44が膜型メタロプロテアーゼによって細胞外ドメインで切断されることが癌細胞運動に大きく関与している。本研究では、活性化型H-RasのCD44切断への関与と細胞運動への影響、並びにその制御機構について検討を行った。まずNIH3T3細胞にH-RasV12の発現ベクターを導入したところ、葉状仮足形成の誘導、及びCD44の同部位への集積を認めた。そこでLacリプレッサー・オペレーターを用いた遺伝子発現システムによるH-RasV12の誘導発現株であるNIH3T3 RasValA1細胞を用いて、H-RasV12発現誘導時のCD44の切断活性を定量したところ、誘導前と比較して有意な亢進を認めた。この反応はメタロプロテアーゼ阻害剤であるBB2516の前処理によって抑制された。この現象の細胞運動に及ぼす影響を検討するためにケモタキシスチャンバーを用いたmigration assayを施行したところ、CD44のリガンドであるヒアルロン酸上での細胞運動能はH-RasV12の発現誘導によって有意に亢進し、 BB2516の存在下では著明に抑制された。一方他の細胞外マトリックスであるフィブロネクチン上での細胞運動能はH-RasV12の発現誘導により軽度亢進するも、BB2516の存在下において有意な低下を認めなかった。CD44の切断活性の亢進に関与するH-Rasの下流分子を同定するために、CD44Hの発現ベクターを導入したNIH3T3 RasValA1細胞をMEK阻害剤であるPD98059またはPI3キナーゼ阻害剤であるLY294002で前処理した後にH-RasV12を発現誘導したところ、LY294002処理群においてCD44切断活性亢進の抑制を認めたが、PD98059処理群では抑制が認められなかった。さらにPI3キナーゼの触媒サブユニットであるp110のドミナントアクティブ変異体の発現ベクター導入によりCD44切断活性が有意に亢進したため、活性化型H-RasはPI3キナーゼを標的分子として、CD44の切断活性を亢進させていることが分かった。さらに、活性化型H-Rasによる形質転換の際に重要な役割を果たしているRhoファミリー低分子量GTP結合型タンパク質の関与を検討しするために、RhoファミリーG蛋白質のドミナントネガティブ変異体の発現ベクターを導入したところ、Cdc42及びRac1のドミナントネガティブ変異体はH-RasV12によるCD44切断活性の亢進を抑制した。したがって、活性化型H-RasによるCD44切断活性亢進にはCdc42およびRac1が関与していることが示唆された。
以上のデータより、CD44のPI3キナーゼ及びRhoファミリーG蛋白質を介した細胞外領域における切断は活性化型Ras依存性の細胞運動制御においての重要な分子メカニズムであることが考えられる。