Fujita N, Shimotake N, Ohki I, Chiba T, Saya H, Shirakawa M, Nakao M.
Mol Cell Biol 20: 5107-5118, 2000
MBD1 is a mammalian protein that binds symmetrically methylated CpG sequences and regulates gene expression in association with DNA methylation. This protein possesses a conserved sequence, named methyl-CpG binding domain (MBD), among a family of methyl-CpG binding proteins that mediate the biological consequences of the methylation. In addition, MBD1 has at least five isoforms due to alternative splicingevents, resulting in the presence of CXXC1, CXXC2, and CXXC3 in MBD1 isoforms v1 (MBD1v1) and MBD1v2, and CXXC1 and CXXC2 in MBD1v3 and -v4. In the present study, we have investigated the significance of MBD, CXXC, and the C-terminal transcriptional repression domain (TRD) in MBD1. A bacterially expressed MBD binds efficiently to densely methylated rather than to sparsely methylated DNAs. In bothmethylation-deficient Drosophila melanogaster SL2 cells and mammalian CHO-K1 cells, MBD1v1 represses transcription preferentially from both unmethylated and sparsely methylated promoters, while MBD1v3 inhibits densely methylated but not unmethylated promoter activities. The CXXC3 sequence in MBD1v1 is responsible for the ability to bind unmethylated promoter. Furthermore, we have constructed mutant-type MBD1s in which the functionally important residues Arg22, Arg30, Asp32, Tyr34, Arg44, Ser45, and Tyr52 are changed to alanine to investigate the correlation between the structure and function of the MBD in MBD1. Excepting those for Ser45 and Tyr52, none of the recombinant MBD mutants bound to the densely methylated or unmethylated DNAs, and green fluorescent protein-fused MBD1 mutants did not localize properly in the nucleus. All the MBD1v1 and -v3 mutants lost the activity of methylation-dependent gene repression. Based on these findings we have concluded that MBD1 acts as a transcriptional regulator depending on the density of methyl-CpG pairs through the cooperation of MBD, CXXC, and TRD sequences. PMID: 10866667 [PubMed - indexed for MEDLINE]
メチル化CpG結合タンパク質はメチル化されたDNAに特異的に結合して、遺伝子転写およびクロマチン構造を制御する重要な分子群である。既報のメチル化CpG結合タンパク質MeCP2のメチル化CpG結合ドメイン（MBD）のアミノ酸配列を用いた相同性検索から、MBD1(methyl-CpG binding domain protein 1)のヒト遺伝子を新たにクローニングした。4つの選択的スプライス型を見い出して、MBD1アイソフォーム（MBD1v1、MBD1v2、MBD1v3、MBD1v4）と名付けた。MBD1は、N末端側にMBDと核移行シグナル、また中央部にシステインに富むCXXC制御ドメインを3個（MBD1v1, MBD1v2）または2個（MBD1v3, MBD1v4）、さらにC末端には転写抑制に働くドメイン(TRD)があることを明らかにした。緑蛍光タンパク質と融合させて局在を調べてみると、MBD1は細胞核内で複数のフォーカスを形成していた。MBD1は染色体上のユークロマチン領域 (遺伝子転写が活発に行われている領域)に広く分布し、また、癌細胞で変異しやすい高度にメチル化されたヒト染色体1q12領域に存在していた。メチル化で転写調節を受ける癌抑制遺伝子p16とインプリンティングで制御されるSNRPN遺伝子のCpGアイランドを含むプロモーター領域を用いて、MBD1のメチル化依存的なDNA結合活性や転写調節について解析を行った。哺乳類細胞およびDNAメチル化自体を有しないショウジョウバエ細胞を用いて、MBD1スプライス型の全てがメチル化されたプロモーターの転写を抑制すること、さらに、MBD1v1は低メチル化プロモーターを、MBD1v3は高メチル化プロモーターを優先的に抑制することが判明した。このアイソフォームの機能の相違は、MBD1v1のN末端から３番目のCXXC3ドメインが非メチル化およびメチル化DNAに直接結合するという結果から説明された。さらに、メチル化DNAへの結合を担うMBDドメインの機能を詳細に検討するために、各種のMBD変異体の発現システムを構築した。大腸菌で作製した野生型MBDタンパク質はメチル化DNAに結合するのに比較して、すべてのMBD変異体はその結合活性および細胞核内でのメチル化依存的な局在を失った。さらに、MBD1v1およびMBD1v3のMBD変異体はメチル化プロモーターの転写を抑制することができなかった。以上の結果から、MBD1がMBD、CXXC、TRDの3つ機能ドメインを有すること、様々なメチル化CpG密度に対応する極めてユニークな転写制御因子であることを結論した。